来源TMRPublishingGroup
作者TraditionalMedicineResearch编辑部研究亮点
鸦胆子油乳（从中药鸦胆子中提取）通过PI3K/AKT通路，上调C-caspase3、C-caspase9、Bax和AMPK（AMP依赖的蛋白激酶），下调Bcl-2和雷帕霉素作用靶点，来抑制肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。
研究背景
中药鸦胆子Bruceajavanica(L.)Merr.系苦木科植物，多产自我国东南部、南部和西南部，其味苦，性寒，有小*。我国民间主要以种子入药，功效清热解*、截疟止痢、杀虫、腐蚀赘疣等。鸦胆子油乳（BJO）由其干燥的成熟果实提取的脂肪油经乳化作用制成，其主要活性成分油酸及亚油酸具有很强的抗癌活性，与肿瘤细胞膜有特异的亲和力，长期以来一直被用作治疗恶性肿瘤的药物。然而，其抗癌机制尚不清楚。
拟解决的关键科学问题
本研究的目的是探讨鸦鸦胆子油乳治疗肝癌细胞的机制。
研究方法
采用CCK8法检测细胞活力；采用Hoechst染色和流式细胞术检测细胞凋亡情况；采用Mito-TrackerRedCMXRos试剂盒检测线粒体膜电位；ATP检测试剂盒检测ATP水平；Westernblot检测AKT、AMPK、Caspase3、Caspase9、Bax和Bcl-2的存在。
研究结果
首先，研究者发现：鸦胆子油乳降低了肝癌细胞的存活率；
图鸦胆子油乳对HepG2的存活率的影响(A),Huh7(B)和(C)L02细胞。
注：不同浓度的细胞治疗BJO(0、12.5、25、50、、或μg/mL,分别24h,48h,72h)
其次，研究者发现：鸦胆子油乳触发HepG2细胞凋亡；
图鸦胆子油乳诱导HepG2细胞凋亡。
注：用不同浓度的BJO(0、50、和μg/mL)处理HepG2细胞24小时。(A)Hoechst染色图像。(B)AnnexinV/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡。(C)凋亡细胞的统计分析。数据显示为三个独立实验的平均值±SD。a:与对照组相比P0.05,b:与对照组相比P0.。(D)Westernblot检测凋亡相关蛋白表达水平。
然后，为了进一步验证线粒体介导通路是否参与了鸦胆子油乳诱导的细胞凋亡，研究者采用Mito-TrackerRedCMXRos染色法观察BJO处理的HepG2细胞线粒体形态。
发现：随着鸦胆子油乳浓度的增加，红色荧光强度逐渐减弱（图A）。在ATP水平方面，结果显示，与对照组相比，鸦胆子油乳处理的HepG2细胞ATP水平呈下降趋势(P0.05,50μg/mL鸦胆子油乳组较对照组；当和μg/mLBJO组与对照组比较时，P0.)(图B)。
图鸦胆子油乳对HepG2细胞MMP和ATP水平的影响。
注：(A)用不同浓度的鸦胆子油乳(分别为0、50、和μg/mL)处理HepG2细胞24h，用Mito-TrackerRedCMXRos试剂盒测定MMP。(B)用ATP检测试剂盒检测ATP水平，数据显示为三个独立实验的平均值±SD。a:与对照组相比P0.05,b:与对照组相比P0.。
然后，为了评估鸦胆子油乳对PI3K/AKT通路的影响，研究者分析了BJO处理的HepG2细胞中AKT的激活水平。
结果表明，增加鸦胆子油乳浓度后(磷酸化的)p-AKT/AKT比值降低，且鸦胆子油以剂量依赖的方式抑制了AKT的磷酸化(图A)。鸦胆子油乳以剂量依赖的方式促进AMPK磷酸化，并在增加鸦胆子油乳浓度后抑制p-mTOR/mTOR比值。
图鸦胆子油乳对HepG2细胞PI3K/AKT通路的影响。
注：(A)用不同浓度的鸦胆子油乳(分别为0、50、和μg/mL)处理HepG2细胞24h,Westernblot检测AKT和p-AKT(Ser)蛋白水平。(B)Westernblot检测p-AMPK和p-mTOR蛋白水平。
最后，为了验证PI3K/AKT信号通路是否触发了诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖的作用，研究者使用了PI3K/AKT激活剂Y-P。
发现：鸦胆子油乳处理后C-caspase3、C-caspase9和Bax表达上调，Bcl-2表达下调。鸦胆子油抑制PI3K/AKT通路，促进单磷酸腺苷激活蛋白激酶的磷酸化，同时抑制雷帕霉素机制靶点的磷酸化。与鸦胆子油乳单独治疗相比，PI3K/AKT激动剂Y-P可提高HepG2细胞存活率(P0.01)，减弱鸦胆子油乳对细胞凋亡的抑制作用(P0.05)。
图鸦胆子油乳通过PI3K/AKT通路抑制HepG2细胞增殖，诱导细胞凋亡。
注：(A)将μg/mLBJO单独或与15μM的Y-P联合作用HepG2细胞24h，用CCK8法检测细胞存活率。(B和C)AnnexinV-FITC/PI染色流式细胞术检测HepG2细胞凋亡。(D)Westernblot检测p-AKT(Ser)、p-AMPK和凋亡相关蛋白水平。a:与对照组相比P0.,b:与单独鸦胆子油乳处理的细胞相比P0.05,c:与单独鸦胆子油乳处理的细胞相比P0.01。
研究结论
鸦胆子油乳可通过PI3K/AKT通路抑制HepG2细胞增殖，诱导细胞凋亡。具体机制为：鸦胆子油乳上调了HepG2细胞C-caspase3、C-caspase9和Bax的表达水平，下调了Bcl-2的表达水平。同时，AKT、mTOR磷酸化水平降低，AMPK磷酸化水平升高。
假说图解如下：
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